Nos homens, a testosterona é secretada pelas células adultas de Leydig e é controlada principalmente pelo hormônio luteinizante (LH). A maior parte da testosterona sérica está ligada à globulina de ligação dos hormônios sexuais (SHBG), mas também existe em ligação solta com a albumina e em estado livre. Nos homens, um nível de testosterona total anormalmente baixo pode indicar hipogonadismo, hipopituitarismo, hiperprolactinemia, insuficiência renal, cirrose hepática ou síndrome de Kleinfelter. Valores elevados de testosterona total nos homens podem ser causados por tumores das glândulas suprarrenais ou dos testículos, hiperplasia congênita das glândulas suprarrenais ou anomalias do eixo hipotalâmico-pituitário-testicular.
Nas mulheres, a testosterona é produzida nos ovários, nas glândulas suprarrenais e nos tecidos adiposos periféricos, e tem uma concentração sérica aproximadamente 10 vezes menor do que nos homens. Como para os homens, a maior parte da testosterona sérica nas mulheres está ligada à SHBG e à albumina com uma pequena quantidade em estado livre. Níveis de testosterona total elevados nas mulheres podem indicar síndrome ovariana policística (PCOS), hipertecose estromática, tumores ovarianos e das glândulas suprarrenais, hiperplasia congênita das glândulas suprarrenais e outros distúrbios do eixo hipotalâmico-pituitário-ovariano.