A cultura é considerada o padrão ouro para o diagnóstico de infecções causadas por espécies do gênero Mycobacterium, uma vez que apresenta sensibilidade superior à da microscopia. Utiliza-se  um meio sólido e um meio líquido em todos os materiais clínicos. O uso do sistema automatizado MGIT 960 para incubação do meio líquido permite a detecção das amostras positivas com maior precocidade (de 7 a 14 dias), mas o prazo final para a liberação das culturas negativas permanece o de 50 dias.  A detecção de micobactéria não pertencente ao Complexo M.tuberculosis (MNT) em material do trato respiratório não pode ser utilizada como o único critério para diagnóstico de micobacteriose pulmonar. Um aspecto importante é que o crescimento de MNT em cultura pode prejudicar a detecção de M. tuberculosis.  O teste de sensibilidade de micobactérias é útil na detecção da resistência em isolados do complexo M. tuberculosis, sobretudo nos casos onde ocorre suspeita de falha terapêutica. Nas infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido permite o ajuste da terapêutica empírica. Para o complexo M. tuberculosis, como drogas de primeira linha, são testadas rifampicina, etambutol e isoniazida, utilizando-se o sistema Bactec 960. Como drogas de segunda linha, são testadas a estreptomicina e a ofloxacino pelo método das proporções, mas em cepas apresentando resistência a múltiplas drogas.  Para micobactérias de crescimento rápido, a metodologia utilizada é a microdiluição em caldo. São testados os seguintes antimicrobianos: amicacina, tigeciclina, doxiciclina, ciprofloxacino, claritromicina, linezolida, cefoxitina (apenas para M. abscessus), tobramicina (apenas para M. chelonae) e sulfametoxazol-trimetoprim (apenas para M. fortuitum). Para M. kansasii são testadas rifampicina e etambutol. Para M. avium/intracellulare é testada apenas a claritromicina ou azitromicina.